ВведениеВ течение последних десятилетий особыйисследовательский интерес вызывают дрожжи. Онисодержат множество ценных питательных веществкак для человека, так и для животных. Дрожжевыеавтолизаты являются своеобразными концентратамиводорастворимых компонентов дрожжей, получен-ных при самолизисе дрожжевой клетки. В составтаких автолизатов входят аминокислоты, пептиды,углеводы и минеральные вещества. Автолизатыактивно применяются в пищевой промышленностикак вкусоароматические добавки в различныхкатегориях продуктов и питании животных. Дрож-жевые автолизаты считаются перспективнымистимуляторами роста растений за счет содержанияв них различных ростовых соединений (тиамин,рибофлавин, никотиновая кислота, пиридоксин идругие витамины группы В), цитокинов и многихдругих питательных веществ [1]. По даннымC.-L. Chang и T.-H. Kao, применение спиртовыхэкстрактов остаточных пивных дрожжей на моде-льных животных позволяет бороться с ожирением,уменьшать уровень триглицеридов в печени исыворотки крови, повышать антиоксидантнуюактивность в печени [2].К сожалению, существует недостаток литера-турных данных касающихся антиоксидантнойактивности дрожжевых автолизатов, которая форми-руется за счет глутатиона.Открытие глутатиона связывают с исследованиемJ. de Rey-Paihade (1888 г.), в ходе которого он былполучен из дрожжевого экстракта, а также животныхтканей. Тогда соединение получило название«филотион» (philothion) [3]. Предполагалось, что«филотион» является дипептидом, образованнымиз цистеина и глутамина. Свое название глутатионполучил в 1921 г. благодаря исследованиямФ. Г. Хопкинса [3]. В 1927 году обнаружилось, чтоглутатион не дипептид, а трипептид. Однако не былидентифицирован содержащийся в нем глицин.Только в 1929 г. удалось доказать, что третьейаминокислотой, входящей в состав трипептида,является глицин [4].В течение полувека глутатион был обнаружен вовсех клетках животных, растений, микроорганизмов вмилимолярных концентрациях [3, 5, 6]. В литературеимеются данные о содержании глутатиона внекоторых свежих фруктах и овощах. Также естьсведения о деградации глутатиона в процессетермической обработки [7].Из-за своих физиологических свойств глута-тион широко применяется в фармакологии, пищевойпромышленности и в косметических продуктах дляобеспечения, к примеру, защиты против окислите-льного разрушения. По оценкам экспертов, мировоеежегодное производство чистого кристаллизованногоглутатиона и дрожжевых экстрактов (15 % GSH), обо-гащенных глутатионом, превышает 200 и 800 тоннсоответственно. Ожидается, что в 2019 году объемпродаж превысит 9 млрд. долларов США [32].В пищевой промышленности глутатион исполь-зуется для улучшения качества теста, усиления вкуса«кокуми», предотвращения окрашивания продуктов,вызванного аминокарбонильной реакцией принагревании сахаров с аминокислотами. В настоящеевремя очищенный глутатион также применяется вмедицине в борьбе с раковыми заболеваниями [5].Дрожжи-сахаромицеты являются дешевым источни-ком этого соединения [8].Abstract.Introduction. Yeast is a fast-growing single-celled microorganism and an inexpensive source of various biologically active substances,such as antioxidants, e.g. Glutathione (GSH). Antioxidant properties are determined by the presence of sulfhydryl group. The globaldemand for glutathione is estimated to exceed 9 billion USD at the expense not only of pure crystalized glutathione, but also ofglutathione-enriched yeast extracts. In the food industry, glutathione is used to improve the quality of the dough and enhance the tasteof various products. The present research featured domestic and foreign studies on the content of glutathione in yeast, methods ofbiosynthesis, and antioxidant properties.Results and discussion. The content of glutathione ranges from 0.1 to 1% per completely dry biomass (CDB) in wild yeast strains. Thefermentative method for the accumulation of glutathione is based on the optimization of the nutrient medium and the use of glutathioneprecursors, i.e. cysteine, glutamic acid, and glycine. Thus, this method makes it possible to double the content of intracellularglutathione in certain cultivation conditions. The use of non-directed mutagenesis methods can increase glutathione synthesis up to5% in separate mutant strains, although the mechanism of synthesis is not always clear under such conditions. However, up to 2.27%of glutathione is being formed under directed change of the genome. In addition, the level of glutathione in cells increases under theinfluence of certain physical factors. For example, glutathione biosynthesis increases by 39% if yeast is exposed to a magnetic field.The enzymatic method requires maintaining the following factors: the presence of precursors (L-glutamic acid, L-cysteine, glycine),ATP, Mg2+ ions to activate GSH1 and GSH2, the pH of the medium, and the introduction of the necessary enzymes into the bioreactor.Hiwever, this method is non-economically profitable in large scale productions due to the needs in use ATP.Conclusion. The survey research demonstrated the effect of technological characteristics of cultivation and biotechnologicalproperties of Saccharomyces cerevisiae on the accumulation of glutathione.Keywords. Fungi, Saccharomyces cerevisiae, oligopeptides, cultivation, antioxidative activityFor citation: Meledina TV, Morozov AA, Davydenko SG, Ternovskoy GV. Yeasts as a Glutathione Producer. Food Processing:Techniques and Technology. 2020;50(1):140–148. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.21603/2074-9414-2020-1-140-148.142Meledina T.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 1, pp. 140–148Объекты и методы исследованияОбъектами исследования служили научныепубликации, посвященные вопросам увеличениясодержания глутатиона в дрожжевых клеткахвида Saccharomyces cerevisiae. Основным методомисследований стал сравнительный анализ данныхотечественных и зарубежных ученых по содержаниюглутатиона и методам его накопления в дрожжах.Результаты и их обсуждениеСинтез и деградация глутатиона. Глутатионобразуется посредством двух ферментативныхреакций в цитозоле:Синтез γ-Глу-Цис из аминокислот L-цистеинаи L-глутаминовой кислоты, катализируемойγ-глутамилцистеин синтетазой, γ-GCS (кодируетсягеном GSH1), для функционирования которогонеобходимо присутствие ионов Mg2+ или Mn2+ [9, 10].В S. cerevisiae ген GSH1, содержащий 2034 спарен-ных оснований (base pair), кодирует Gsh1p из678 аминокислотных остатков;Синтез глутатиона из γ-Глу-Цис и глицинакатализируется глутатион синтетазой ( L-γ-глутамил-цистеин-глицин γ-лигазой) (кодируется GSH2) [11].Большая часть глутатиона остается в цитозоле, нонекоторая часть обнаруживается в таких органеллах,как митохондрии, ядре, эндоплазматическом ретику-луме и вакуолях.При чрезмерном накоплении глутатионапроисходит ингибирование γ-GCS. В организмечеловека недостаток глутатион-синтетазы вызываетчрезмерное накопление γ-глутамилцистеина, которыйпереходит в 5-оксопролин (пироглутаминовая кисло-та), что может вызвать метаболический ацидоз,гемолитическую анемию и поражение центральнойнервной системы [10].Обе стадии являются АТФ-зависимыми. В синтезглутатиона вовлечены два транскрипционныхфактора Met4p и Yap1p [6].Известно, что многие организмы и при отсутствииGsh1 и Gsh2 способны производить глутатион,что предполагает наличие других путей синтеза.Недавно в бактериях был обнаружен единственныйбифункциональный фермент γ-глутамилцистеинситнтетаза/глутатион синтетаза (γ-GCS-GS или GshF,кодируемая gshF), способный осуществлять синтезглутатиона [37].Деградация глутатиона происходит поддействием γ-глутамилтранспептидазы ( γ-ГТ, Cis2,Ecm38), являющейся единственным ферментом,разрушающим глутатион за счет переноса γ-глута-мильной группы глутатиона и других соединенийс данной функциональной группы до образованияаминокислот [33].Предполагается, что конечной ступеньюдеградации глутатиона является действиеL-цистеинил-глицин-дипептидазы (Dug1), катализи-рующей распад L-цистеинил-глицина до соответ-ствующих аминокислот.Экспрессия гена CIS2 регулируется источникомазота. В присутствии ионов аммония происходиларепрессия гена CIS2. Следует отметить, что при азотномголодании происходит индуцированние γ-ГТ. Длявосполнения потребности в азоте происходит рело-кация более 90% глутатиона в центральную вакуоль.То же происходит и в том случае, если глутатионявляется единственным источником серы [6].Обобщенная схема синтеза и деградацииглутатитона представлена на рисунке 1, где вкачестве источника серы для синтеза глутатионаможет служить метионин, цистеин, гомоцистеин.Также глутатион может быть включен в клеткунепосредственно из внеклеточного пространстваза счет высокоаффинного переносчика GSH-P1 инизкоафинного переносчика GSH-P2.В клетке глутатион обычно представленвосстановленной (GSH, более 90 %) и окисленнойРисунок 1. Схема синтеза и деградации глутатиона:1) серин ацетилтранфераза; 2) цистеин синтаза;3) гомосерин ацетилтрансфераза; 4) гомоцистеин синтаза;5) γ-цистатионин синтаза; 6) γ-цистатионаза;7) β-цистатионаза; 8) β-цистатионин синтаза;9) гомоцистеин метилтрансфераза; 10) S-аденозилметионинсинтаза; 11) S-аденозилметионин деметилаза;12) аденозилгомоцестеиназа; 13) сульфатредуцирование;14) γ-глутаминцистеин синтаза; 15) глутатион синтаза;16) γ-глутамилтранспептидаза;17) L-цистеинил глицин дипептидаза [6]Figure 1. Scheme of the synthesis and degradation of glutathione:1) serine acetyltransferase; 2) cysteine synthase; 3) homoserineacetyltransferase; 4) homocysteine synthase;5) γ-cystathionine synthase; 6) γ-cystathionase; 7) β-cystathionase;8) β-cystathionine synthase; 9) homocysteine methyltransferase;10) S-adenosylmethionine synthase; 11) S-adenosylmethioninedemethylase; 12) adenosyl homocesteinase; 13) sulfate reduction;14) γ-glutamine cysteine synthase; 15) glutathione synthase;16) γ-glutamyltranspeptidase; 17) L-cysteinyl glycine dipeptidase [6]ПереносчикиглутатионаСульфатныйтранспорт143Меледина Т. В. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50. № 1 С. 140–148(GSSG, около 10 %) формами. Окисление GSH при-водит к образованию GSSG, который может бытьвосстановлен в присутствии НАДФН(Н+) под дей-ствием глутатион редуктазы, кодируемой GLR1 [12].Дрожжи как продуценты глутатиона. Известныразличные способы биосинтеза глутатиона [8].В основе одного из способов (энзиматическийс применением ферментов) лежит поддержаниеследующих факторов: наличие прекурсоров(L-глутаминовой кислоты, L-цистеина, глицина),АТФ, ионов Mg2+ для активации GSH1 и GSH2,рН среды, а также внесение в биореакторнеобходимых ферментов. Для протекания процессаоптимальными являются температура 30–35 °C иpH 7,3–7,5 [39]. Необходимость применения ATФделает энзиматический способ более сложнымдля масштабирования из-за экономическойнецелесообразности. Низкая активность GSH1и GSH2 является лимитирующим фактором вбиосинтезе глутатиона, что потребовало примененияметодов генной инженерии.Альтернативным и наиболее часто используемымметодом является ферментативный способ сприменением различных микроорганизмов, восновном S. cerevisiae и Candida utilis, из-за ихспособности к быстрому росту и образованиювысоких концентраций клеток в среде.Дикие штаммы S. cerevisiae содержат от 0,1до 1 % глутатиона на сухую биомассу. В пивоварен-ных дрожжах уровень глутатиона колеблется от 0,6до 1,0 % [15]. Применение различных мутантныхштаммов позволяет увеличить содержание до 3–5 %.Наиболее высоким содержанием глутатиона является9,5 % [13].Применяются различные пути накопления глута-тиона в дрожжах: использование мутагенных штаммовс высокой накопительной способностью к глутатиону,внесение аминокислот-прекурсоров [23, 34].Преимуществами ферментативного метода полу-чения глутатиона является получение более высокихконцентраций – до 9 г/л [32]. Использование раз-личных углевод-содержащих субстратов являетсянаиболее изученным и применимым, в отличие отиспользования прекурсоров, удорожающих готовыйпродукт.Рассматривалось влияние источников азота насинтез глутатиона дрожжами. Сульфат аммония,являясь источником как азота, так и серы, необходимдля увеличения плотности биомассы и образованияглутатиона [23].Немаловажным фактором при производствеглутатиона является не только оптимизацияпитательной среды, включая добавление различныхисточников питательных веществ, но и, к примеру,момент добавления прекурсоров [19–22]. Хотьсахара и являются основным субстратом (какисточник углерода), применение L-цистеина являетсяключевым в производстве глутатиона [13]. Наличиецистеина значительно увеличивает внутриклеточнуюконцентрацию глутатиона [35].Добавление цистеина в экспоненциальную фазузамедляет рост клеток за счет появления эффектаКребтри из-за того, что образование этанола ведет кподавлению цикла трикарбоновых кислот. ВнесениеL-цистеина в стационарную фазу положительносказывается на содержании глутатиона (1,76 % наСВ) [23]. Имеет значение также и дозировка внесенияL-цистеина [24].W. Li и др. предлагают применять двухсту-пенчатую реакцию, при которой на первойступени добавляют необходимые прекурсоры, заисключением глицина, для образования толькоγ-глутамилцистеина. На второй ступени (через7,5 часов от начала культивирования) добавляютглицин для образования глутатиона [14].Приведенные данные позволяют судить о том, чтоприменение двухступенчатой реакции повышаетвыход глутатиона почти в 2 раза, в сравнении содноступенчатой, при которой 3 аминокислоты-прекурсоры добавляются одновременно [14].Следующей важной особенностью являетсяконтроль концентрации этанола. В экспериментеS. Wen с соавторами показано, что вусловиях введения в среду прекурсоров и принизкой концентрации спирта (0,08–0,65 %)происходит большее накопление глутатионадрожжами и биомассы – 2190 мг/л и133 г/л соответственно [36].При сверхэкспрессии GSH1/GLR1 происходитдвукратное увеличение содержания внутрикле-точного глутатиона и более высокое образованиеэтанола, чем у диких штаммов: 14 г/л и 8,2 г/лсоответственно [16].Для получения матантных штаммов применяютсяфизический и химический методы мутагенеза: УФ,Х- и γ-излучения, метилнитронитрозогуанидин и др.Главной проблемой случайных мутаций являетсянепредсказуемость и бесконтрольность.G. M. Hamad и др. получили мутацию дрож-жей S. cerevisiae посредством использования этилме-тансульфоната [17]. Один из мутантных штаммов(MG40/S.C/4) был способен производить в 49 разбольше глутатиона по сравнению с исходнымштаммом.Z.-Y. Wang с соавторами показал, чтосамоклонирование пивоваренных дрожжей приводитк 1,9-кратному увеличению содержания глутатиона вштамме T5-3. Содержание глутатиона наблюдалоськак внутри клетки, так и в культуральнойжидкости [18].В исследовании L. Tang и др. рекомбинантныйштамм W303-1b/FGP способен накопить 2,27 % внут-риклеточного глутатиона после 24 ч брожения [37].Особенностью данного штамма служит применение144Meledina T.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 1, pp. 140–148метода независимой или комбинаторной генети-ческой интеграции, где два искусственно рекомби-нантных фермента GSH2/GSH1 S. cerevisiae,гибрид Pro1/GSHB S. cerevisiae и E. coli и ресинте-зированный GSHF Actinobacillus pleuro-pneumoniaeбыли введены в геном S. cerevisiae.Применение различных физико-химических мето-дов также позволяет влиять на выход глутатиона(например, воздействие магнитных полей). Так,L. O. Santos и др., воздействуя магнитным полем наштамм S. cerevisiae ATCC 7754, добились увеличениясодержания глутатиона на 39 % по сравнению снеобработанными дрожжевыми клетками [25].Также отмечается, что при хранении как сухих,так и прессованных дрожжей, происходит увеличениесодержания глутатиона в зависимости от сроковхранения [26, 27].Антиоксидантная роль глутатиона. Окислите-льный стресс – неизбежная часть жизни в аэробныхусловиях. Потребность в кислороде приводит кобразованию активных форм кислорода (АФК).Увеличение окислительного стресса в клеткеприводит к изменению/повреждению различныхвеществ клетки. Это приводит к нарушению фун-кциональной способности и гибели клетки [10, 28].В обычных условиях АФК и активные формыазота (АФА) участвуют в редокс-сигналинге, регули-рующих активность важных для клетки белков,жизненно важных процессов (рост, клеточныециклы, апоптоз) [29]. Процессы редокс-сигналингамогут протекать во всех участках клетки, вовлекаяразличные редокс-пары. Интересующей нас паройявляется пара GSH/GSSG [38].Главным функциональным элементом в молекулеглутатиона является остаток аминокислоты цистеина,имеющей реакционноспособную сульфгидрильнуюгруппу (тиольную группу). При переходе извосстановленной формы в окисленную глутатионподвергается S-глататионилированию – процессобразования дисульфидной связи между остаткамицистеина белка и молекулы GSH. Данный процесспозволяет защитить клетку от окислительногостресса [30].Важным моментом является обратимость окисле-ния остатков цистеина. Катализатором реакция тиол-дисульфидного обмена in vivo являются специали-зированные белки – глутаредоксины. Незначительныеизменения в тиол-дисульфидном равновесии могутпривести к гибели клетки, поэтому для отраженияобщего редокс-статуса клетки используют соотно-шение GSSG/2GSH, которое составляет для клетки1 к 100, изменяясь при различных процессах.В митохондриальном матриксе S. cerevisiaeредокс-потенциал равен –296 мВ, в цитоплазмеравен –286 мВ, а в эндоплазматическом ретикулумеот –190 до –170 мВ, что соответствует соотношениюGSSG/2GSH приблизительно 1/1–1/3 [31].Кроме поддержания редокс-статуса, глутатионслужит субстратом глутатионпероксидаз, участвуятем самым в регуляции работы антиоксидантныхсистем клетки. Глутатионпероксидазы осуществляютреакцию восстановления перекиси водорода.ВыводыВ результате проведенного обзора литературыпоказано влияние технологических характеристиккультивирования, а также биотехнологическихсвойств дрожжей Saccharomyces cerevisiae на процесснакопления глутатиона.Критерии авторстваТ. В. Меледина, А. А. Морозов, С. Г. Давыденко,Г. В. Терновской внесли равнозначный вклад вструктуру обзорного исследования, анализ литера-турных данных и их представление.Конфликт интересовАвторы заявляют об отсутствии конфликтаинтересовContributionThe authors equally contributed to the structure ofthe present survey research, scientific data analysis, andinformation representation.Conflict of interestThe authors declare that there is no conflict of interestregarding the publication of this article.