ВведениеСовременная биотехнология неразрывно связана с использованием новых подходов к отбору природных микроорганизмов при создании бактериальных препаратов.В настоящее время на отечественном рынке имеется широкий ассортимент препаратов на основе молочнокислых бактерий, оказывающих позитивные эффекты на физиологические, биохимические и иммунные реакции организма через стабилизацию его микроэкологического статуса. В последние годы интерес для исследователей представляют пропионовокислые бактерии, которые обладают способностью к синтезу витамина В12 и высокими антимутагенными свойствами [1–3].Важной причиной не всегда убедительной клинической эффективности пробиотических до- бавок является то, что при создании консорциума микроорганизмов подбираются виды бактерий без учета их биосовместимости. Это приводит к подавлению жизнеспособности микроорганизмов и утрате значимых свойств. Опубликованные результаты исследований показали, что, развиваясь в составе консорциумов, штаммы молочнокислых бактерий, в зависимости от уровня их биосовместимости, достигают различного уровня накопления биомассы [4–6].Симбиотические пробиотики являются результатом рационального комбинирования бактериальных пробиотиков и пребиотиков, содержат несколько штаммов бактерий, которые образуют симбиоз антагонистической активности и антибиотической устойчивости. Как правило, комплексные препараты характеризуются более высокими медико-биологическими свойствами по сравнению с отдельными штаммами [7–9].В окружающей среде микроорганизмы при- сутствуют не в виде индивидуальной культуры,а в составе микробиоценозов. Они отличаются высокой жизнеспособностью и по ряду характеристик превосходят чистые, лабораторные культуры.Консорциумы микроорганизмов обычно неустойчивы. Через несколько циклов деления происходит подавление роста одних штаммов за счет преобладания самого активного штамма, наиболее приспособленного к конкретным условиям питательной среды [10–12]. Основная задача разработки комплексного пробиотика заключается в сохранении стабильного состава составляющих его штаммов как на стадиях получения препарата на производстве, так и на стадии применения.В Международном кодексе номенклатуры бактерий понятие консорциума включает в себя ассоциацию из двух или более микроорганизмов. Консорциум могут составлять микроорганизмы, обладающие сходными биологическими и технологическими свойствами, при отсутствии явления антагонизма.Совместное культивирование штаммов в жидкой или плотной питательной среде с последующей констатацией факта стимуляции или угнетения развития лежит в основе методик определения взаимоотношений. Среди бактерий встречаются культуры антагонисты. Они не сочетаются не только с культурами другого вида, но и со штаммами внутри вида [13–15]. Такие штаммы не могут быть использованы в комбинации закваски, состоящей из нескольких культур.Явление синергизма, заключающееся во взаимном усилении биологических свойств отдельных бактерий, дает возможность консорциуму создать единую биологическую систему, обладающую защитными свойствами от влияния других микроорга- низмов [16]. Защитные свойства обусловлены антимикробной активностью бактерий и синтезом целого ряда биологически активных веществ.Volkova G.S. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2021, vol. 51, no. 2, pp. 260–269 Многочисленные исследования показывают, что для создания пробиотических препаратов на основе бактериальных консорциумов, содержащих биологически совместимые штаммы, необходимо в производственных условиях реализовать и поддерживать оптимальные условия существования микробного симбиоза для достижения высоких терапевтических свойств бактериального препарата. Поэтому постановка исследования должна быть направлена как на создание консорциума биологически совместимых штаммов бактерий, так и на поиск оптимальных условий для накопления биомассы и сохранение соотношения титра каждого штамма в консорциуме. Это довольно сложная комплексная задача, требующая проработанной научной основы.В литературе описаны важнейшие характеристики бактериального пробиотического препарата:– высокая жизнеспособность штаммов консорциума, быстрый переход культур в активное состояние;– антагонизм к возбудителю заболевания животного;– отсутствие антагонизма к нормальной полезной микрофлоре животного;– отсутствие антагонизма нормальной микрофлоры к штамму пробиотика;– наличие адгезивной способности у штамма пробиотика;– безопасность препарата;– стабильность характеристик штаммов при производстве и хранении.Для подтверждения заявленного эффекта создаваемого пробиотического препарата необхо- димо провести исследования в клинических лабораториях, работая со штаммами и клиническими изолятами, взятыми из желудочно-кишечногоэти штаммы в качестве компонента современных пробиотических препаратов. Таким образом, подбор биологически совместимых штаммов при соблюдении условий оптимизации соотношений чистых культур молочнокислых и пропионовокислых бактерий является базой для активных симбиозов на основе этих бактерий. В настоящее время является актуальным создание пробиотических препаратов на основе ассоциации молочнокислых и пропионовокислых бактерий с новыми биотехнологическими свойствами для эффективной профилактики нарушения микро-биоценоза желудочно-кишечного тракта [21–23].Целью исследования стала разработка на основе изучения межштаммовых взаимодействий и механизмов адаптации селекционированных штаммов состава симбиотического консорциума молочнокислых и пропионовокислых бактерий перспективного для создания пробиотических препаратов. Объекты и методы исследованияОбъектами исследований служили штаммы- продуценты органических кислот из коллекции ВНИИПБТ: Lactobacillus plantarum 314/8, Lactobacillus helveticus R0052/6, Lactobacillus acidophilus var. coсcoideus М-94/2, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus L-2, Enterococcus faecium 2240/D, Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/27. В качестве основного углеводсодержащего субстрата для молочнокислого брожения исполь- зовалась питательная среда MRS-1, а также среда следующего состава: вода дистиллирован- ная – 600 мл, мясная вода – 400 мл, дрожжевой экстракт – 5,0 г, натрия ацетат – 5,0 г, глюкоза – 2,5 г, аммония цитрат – 2,0 г, К2НРО4 – 2,0 г, Твин 80 – 1 мл, МgSО ·7 Н О – 0,2 г, МgSО ·4 Н О – 0,05 г. Условия4 2 4 2тракта животного [17, 18].При изучении механизма действия пробиотических препаратов внимание исследователей направлено на молочнокислые бактерии, присутствующие в микробиоме кишечника [19, 20]. Описана способность отдельных штаммов пропионовокислых бактерий выживать и присутствовать в желудочно-кишечном тракте в течение 17–20 ч. Это позволяет использоватькультивирования: анаэробно, оптимум рН 5,5–5,8, температура культивирования 37 °С. Культивирование продуцентов проводили в колбах Эрленмейера объемом 750 см3 с 100 см3 питательной среды. В процессе ферментации производили нейтрализацию образующихся кислот раствором 0,1 н NaOH.Изучение биохимических и технологических свойств исследуемых штаммов проводили  Таблица 1. Кинетические показатели роста отобранных штаммов молочнокислых бактерий и образование молочной кислоты на 36 ч ростаTable 1. Kinetic growth parameters of the lactic acid bacteria and the formation of lactic acid after 36 h of growth ШтаммУдельная скорость роста, ч–1Время выхода популяции в стационарную фазу, чКоличество молочной кислоты, г/дм3L. helveticus R0052/60,32 ± 0,1018,2 ± 2,329,0 ± 1,4L. acidophilus var. coсcoideus М-94/20,39 ± 0,1017,5 ± 2,131,5 ± 1,9L. casei subsp. rhamnosus L-20,45 ± 0,1121,2 ± 2,142,2 ± 2,1L. plantarum 314/80,37 ± 0,1022,7 ± 2,235,5 ± 1,8E. faecium 2240/D0,51 ± 0,1221,4 ± 2,233,0 ± 1,8L. lactis subsp. lactis 1500/120,84 ± 0,1420,7 ± 1,336,5 ± 1,8Волкова Г. С. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2021. Т. 51. № 2 С. 260–269 Плотность популяции, млрд КОЕ/см3 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 L. helveticus R0052/6 L. acidophilus var.coсcoideus M-94/2 L. casei subsp.rhamnosus L-2 L. plantarum314/8 E. faecium2240/D L. lactis subsp.lactis 1550/12 P. freudenreichiisubsp. shermanii103/27 Рисунок 1. Максимальная плотность популяцииFigure 1. Maximal population density  стандартными методами. Определение количества микроорганизмов в посевном материале и культуральной жидкости проводили по ГОСТ 26670. Количество клеток (в мл суспензии) устанавливаи по ГОСТ 10444.11 с помощью прямого подсчета числа клеток в единице объема на счетной камере Горяева-Тома. Накопление биомассы бактерий определяли с использованием колориметра КФК-2 нефелометрически. Количество биомассы уста- навливали по калибровочной кривой с учетом разведений. Микроскопирование препаратов – по ГОСТ 9225. Содержание редуцирующих веществ в культуральной жидкости определяли методом Шомоди-Нельсона по ГОСТ 54905. Количество молочной кислоты определяли методом ВЭЖХ по ГОСТ 33410 на приборе Series-200 («PerkinElmer»). Для оценки биосовместимости молочнокислых бактерий использовали метод прямого совместного культивирования на поверхности плотной питательной среды (капельная методика) [19]. 24-часовую культуру бактерий наносили на чашку Петри с плотной средой MRS-1 с помощью петли. Каплю оставляли на чашке до полного ее впитывания. Капля второй культуры наносится со смещением на 1–2 мм от края первой капли, добиваясь затекания на каплю первой культуры. В той части, где произошло наложение капель, оценивают границу, образуемую между культурами. Контролем служат свободные области капель. После подсыхания капель чашки инкубировалив термостате при 37 °С.Наличие антагонизма выявляли визуально через 24 ч роста по признаку подавления одной культуры другой. Если видимая задержка роста показывает антагонистические взаимоотношения исследуемых культур, а граница четко просматривается, то в этом случае культуры считаются биологически несовместимыми. При слиянии пятен культуры являются биосовместимыми. В некоторых случаях визуально отмечается расширение области роста в зоне слияния. В случае выхода в зоне слияния одной культуры на поверхность другой, с подавлением роста второй культуры, то такие культуры считали проявляющими слабый антагонизм. Если визуально определяли зону задержки роста по краю капель культур, то их характеризовали как проявляющие сильный антагонизм.Антагонистические свойства отдельных пар штаммов молочнокислых бактерий изучали по методике Романович [24]. Методика предусматривает, что, если происходило исчезновение окраски метиленовой сини культуральной жидкости консорциума, то реакция считалась положительной. Это свидетельствовало либо о сильной конкуренции за субстрат, либо о несовместимости действия бактериоцинов друг друга. Полное обесцвечивание наступало через 5–8 ч.Биометрическую обработку полученных данных проводили методом вариационной статистики   Рисунок 2. Биосовместимость штаммов Lactobacillus helveticus R0052/6 и Lactobacillus plantarum 314/8 (полное слияние капель)Figure 2. Biocompatibility of Lactobacillus helveticus R0052/6 andLactobacillus plantarum 314/8 (complete confluence of drops)Volkova G.S. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2021, vol. 51, no. 2, pp. 260–269 Таблица 2. Результаты изучения антагонизма ассоциаций бактерийTable 2. Antagonism of bacterial consortia Наименование штаммаФильтрат культуральной жидкостиL. acidophilus var. coсcoideus М-94/2 и L. plantarum 314/8реакция отрицательнаяL. acidophilus var. coсcoideus М-94/2 и L. brevis К-1реакция положительнаяL. casei subsp. rhamnosus L-2 и L. helveticus R0052/6реакция отрицательнаяL. brevis К-1 и L. plantarum 314/8реакция положительнаяL. acidophilus var. coсcoideus М-94/2 и L. casei subsp. rhamnosus L-2реакция отрицательнаяL. plantarum 314/8 и L. helveticus R0052/6реакция отрицательнаяL. casei subsp. rhamnosus L-2 и L. brevis К-1реакция положительная (t-критерии Стьюдента) с использованием Microsoft Excel 9.0. Результаты и их обсуждениеВ результате скрининга высокопродуктивных штаммов молочнокислых бактерий по выходу молочной кислоты и скорости роста из коллекции ВНИИПБТ были отобраны 7 штаммов: Lactobacillus helveticus R0052/6, Lactobacillus acidophilus var. coсcoideus М-94/2, Lactobacillus plantarum 314/8, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus L-2, Enterococcus faecium 2240/D. У них выход молочной кислоты от использованной лактозы был равен или выше 50 %. Также использовали Lactococcus lactis subsp. lactis 1500/12 и Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/27.Результаты определения показателей роста и максимальной плотности популяции для максимальногонакопления биомассы отобранных штаммов приведены в таблице 1 и рисунке 1.Исследование биосовместимости молочнокислых бактерий проводили методом капель на плотной среде МRS-1 (рис. 2). Результатом стало предварительное определение комбинаций штаммов, в которых будет отсутствовать явление антагонизма и конкуренции за субстрат. Первичный отбор позволил составить следующие пары биосовместимых штаммов молочнокислых бактерий:L. acidophilus var. coccoideus M-94/2 и L. plantarum314/8;L. acidophilus var. coсcoideus М-94/2 и L. casei subsp. rhamnosus L-2;L. casei subsp. rhamnosus L-2 и L. helveticus R0052/6;L. helveticus R0052/6 и L. plantarum 314/8.Полученные результаты свидетельствуют о возмо- жности совместного культивирования подобранных  Таблица 3. Подбор соотношения штаммов в консорциуме № 1Table 3. Ratio of strains in consortium No. 1 КультурыТитр клеток, lg КОЕ/см3Соотношение штаммов в консорциуме1:1:1:11,5:1:1:0,51,5:1,5:0,5:0,52:0,5:1:0,5L. plantarum 314/89,17 ± 0,469,23 ± 0,469,14 ± 0,469,26 ± 0,46L. helveticus R0052/69,17 ± 0,469,00 ± 0,458,11 ± 0,408,70 ± 0,44E. faecium 2240/D9,14 ± 0,469,00 ± 0,458,00 ± 0,409,00 ± 0,45P. freudenreichii subsp. shermanii 103/279,01 ± 0,458,00 ± 0,408,00 ± 0,408,00 ± 0,40 Таблица 4. Подбор соотношения штаммов в консорциуме № 2Table 4. Ratio of strains in consortium No. 2 КультурыТитр клеток, lg КОЕ/см3Соотношение штаммов в консорциуме1:1:1:11,5:1:1:0,51,5:1,5:0,5:0,52:0,5:1:0,5L. casei subsp. rhamnosus L-29,15 ± 0,469,18 ± 0,469,08 ± 0,459,20 ± 0,46L. acidophilus var. coсcoideus М-94/29,08 ± 0,459,00 ± 0,459,00 ± 0,459,00 ± 0,45E. faecium 2240/D9,08 ± 0,458,00 ± 0,408,04 ± 0,408,70 ± 0,44P. freudenreichii subsp. shermanii 103/279,08 ± 0,458,00 ± 0,408,11 ± 0,408,00 ± 0,40В таблицах 3 и 4 данные статистически достоверны при Р ˂ 0,05 (n = 3). In Tables 3 and 4, the data are statistically significant at P ˂ 0.05 (n = 3).Волкова Г. С. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2021. Т. 51. № 2 С. 260–269  Оптическая плотность, ед. 4 3 2 1 00 4 8 12 16 20 24Время культивирования, ч Консорциум 1 Консорциум 2 Данные статистически достоверны при Р ˂ 0,05 (n = 3) Рисунок 3. Накопление биомассы консорциумами бактерий на глюкозной средеFigure 3. Biomass accumulationby bacterial consortia in glucose medium пар штаммов молочнокислых бактерий для получения многокомпонентных пробиотических препаратов определенного состава. Выборочные ассоциации штаммов и некоторые другие пары были проверены на антагонизм по методике Романович [24]. Результаты представлены в таблице 2.Комбинации штаммов, дающие отрицательную реакцию с метиленовой синью, могут быть рекомендованы для составления комбинированной закваски.На основе визуальной оценки биосовместимости штаммов молочнокислых бактерий были отобраны две пары с наилучшим синергизмом, на основе которых составлены два консорциума:L. plantarum 314/8, L. helveticus R0052/6, E. faecium2240/D, P. freudenreichii subsp. shermanii 103/27;L. acidophilus var. coсcoideus М-94/2, L. casei subsp. rhamnosus L-2, E. faecium 2240/D, P. freudenreichii subsp. shermanii 103/27.Произведен экспериментальный подбор соотношения культур в консорциумах. Выбран оптимальный вариант, при котором культуры присутствуют в равных соотношениях (табл. 3 и 4). Получены экспериментальные данные по динамике накопления биомассы на глюкозной среде (рис. 3)и по содержанию редуцирующих сахаров (рис. 4).Анализ рисунка 3 показывает, что накопление биомассы для каждого консорциума достигает максимума к 24 ч роста. Это говорит о переходе культур в стационарную фазу роста. Дальнейшее увеличение времени культивирования нецелесообразно. На рисунке 4 показано, что к 24 ч культивирования содержание сахаров в питательной среде падает до минимума.В дальнейших исследованиях экспериментально подобрана температура культивирования консорциумов 37 °С. Так как из четырех штаммов консорциумов три штамма – это молочнокислые бактерии с оптимальной температурой для роста 35–37 °С, то это является определяющим фактором. Для штамма пропионовокислых бактерий оптимальной температурой роста является 30–32 °С, а при 37 °С штамм растет с незначительным снижением скорости роста.Изучен состав консорциума № 1 при различном времени роста, а также титр клеток каждого штамма при культивировании. Результаты представлены в таблице 5.Данные таблицы 5 свидетельствуют о сбалансированном росте консорциума № 1, хорошей сочетаемости штаммов, высокой биологической  Содержание редуцирующих веществ, % 2,0 1,5 1,0 0,5 0,00 4 8 12 16 20 24Время культивирования, ч Консорциум 1 Консорциум 2 Данные статистически достоверны при Р ˂ 0,05 (n = 3) Рисунок 4. Динамика содержания редуцирующих веществ в культуральной жидкости при культивированииFigure 4. Content of reducing substances in the culture liquid during cultivationVolkova G.S. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2021, vol. 51, no. 2, pp. 260–269 Таблица 5. Состав консорциума № 1 при культивированииTable 5. Composition of consortium No. 1 during cultivation Время, чТитр жизнеспособных клеток, lg КОЕ/см3КонсорциумL. helveticus R0052/6L. plantarum 314/8E. faecium 2240/DP. freudenreichii subsp.shermanii 103/2767,60 ± 0,387,00 ± 0,357,00 ± 0,357,00 ± 0,357,00 ± 0,35108,62 ± 0,438,04 ± 0,408,04 ± 0,408,01 ± 0,408,00 ± 0,40128,67 ± 0,437,04 ± 0,358,15 ± 0,418,08 ± 0,408,00 ± 0,40189,72 ± 0,499,08 ± 0,459,18 ± 0,468,11 ± 0,419,08 ± 0,45209,74 ± 0,499,18 ± 0,469,18 ± 0,468,11 ± 0,419,08 ± 0,45Данные статистически достоверны при Р ˂ 0,05 (n = 3) Data are statistically significant at P ˂ 0.05 (n = 3). совместимости и отсутствии явления антагонизма. В качестве приоритетного по накоплению биомассы выбран консорциум № 1. Он может быть рекомендован для получения пробиотического препарата, а консорциум № 2 по характеристикам роста уступает консорциуму № 1. Проведена микроскопия культуральных жидкостей через 24 ч роста консорциумов (рис. 5). Микроскопия показывает отсутствие посторонней микрофлоры, высокую плотность популяции, равномерное распределение клеток в поле зрения.Подобранные штаммы определяют высокую биологическую активность консорциума. Это позволяет создать биологический препарат с заданными физиолого-биохимическими и технологическими свойствами. Дальнейшие исследования предполагают проведение молекулярно-генетической идентификации штаммов консорциума, что является важным этапом при производстве пробиотического препарата, обеспечивая чистоту используемых культур и их идентичность, а также безопасность производства [25].Производство пробиотического препарата осуществляется периодическим или непрерывным способами в ферментерах путем биоконверсии a bРисунок 5. Микроскопия культуральной жидкости через 24 ч культивирования на жидкой среде MRS-1 консорциумов № 1 (a) и № 2 (b)Figure 5. Microscopy of the culture liquid after 24 h of cultivation in liquid medium MRS-1: consortia No. 1 (a) and No. 2 (b)молочной сыворотки подобранным консорциумом молочнокислых и пропионовокислых бактерий. Режим культивирования анаэробный, совместное культивирование 4-х штаммов в соотношении 1:1:1:1. Время культивирования 24 ч. Температурный режим культивирования 37 °С.Штаммы молочнокислых бактерий L. plantarum 314/8 и L. helveticus R0052/6, L. acidophillus var. coсcoideus М-94/2 и L. casei subsp. rhamnosus L-2 депонированы в ВКМ ИБФМ им. Г. К. Скрябина под номерами ВКМ В-3478D, ВКМ В-3477D, ВКМ В-3403D и ВКМ В-3402D соответственно.Скрининг высокоактивных штаммов микроорга- низмов для создания новых пробиотических препаратов представляет собой длительный и трудоемкий процесс. Перспективу использования имеют молочнокислые и пропионовокислые бактерии, т. к. являются действующим началом практически всех имеющихся на рынке пробиотических препаратов. Согласно современным научным представлениям, помимо безопасного состава пробитических препаратов, в дальнейших исследованиях необходимо использовать in vitro и in vivo модели для уточнения механизмов действия пробиотиков. При этом каждый предполагаемый биологический эффект необходимо связать с конкретным штаммом, входящим в его состав. Большое значение имеет точная идентификация молочнокислых бактерий, сложность которой состоит в лабильности при проявлении основных характеристик, огромного разнообразия видов, их схожести, а также наличия нетипичных форм.Результатом данной работы стало создание консорциумов пробиотических бактерий, которые имеют перспективу использования при разработке заквасок и пробиотических лечебно-профилактических препаратов, а также продуктов функционального питания. ВыводыПолучены экспериментальные данные по кинетическим показателям роста и способности кВолкова Г. С. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2021. Т. 51. № 2 С. 260–269 синтезу молочной кислоты исследуемых штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий в лабораторных условиях. Установлено, что накопление молочной кислоты может достигать до 4,22 %, удельная скорость роста – 0,32–0,84 ч–1, максимальная плотность популяции – до 2,2×109 КОЕ/см3.На основе изучения биосовместимости штаммов молочнокислых бактерий установлены комбинации штаммов, в которых отсутствует явление антагонизма и конкуренции за субстрат. Это делает их перспективными для создания консорциумов. Подобран состав двух целевых консорциумов с учетом скорости роста и выхода биомассы, выбраны оптимальные варианты соотношения штаммов в их составе, выбран предпочтительный консорциум, включающий штаммы: Lactobacillus plantarum 314/8, Lactobacillus helveticus R0052/6, Enterococcus faecium 2240/D, Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 103/27.Разработаны параметры совместного культиви- рования консорциума: режим культивирования анаэробный, соотношение 4-х штаммов в консорциуме 1:1:1:1, время культивирования 24 ч при 37 °С.Штаммы молочнокислых бактерий L. plantarum 314/8 и L. helveticus R0052/6, Lactobacillus acidophilus var. coсcoideus М-94/2 и Lactobacillus casei subsp. rhamnosus L-2 депонированы в ВКМ ИБФМ им. Г. К. Скрябина под номерами ВКМ В-3478D,ВКМ В-3477D, ВКМ В-3403D и ВКМ В-3402Dсоответственно. Критерии авторстваГ. С. Волкова – рзработка концепции и дизайна исследования, анализ и интерпретация экспериментальных данных, написание статьи и ее редактирование, включающее существенные дополнения в содержании; подготовка промежуточных версий статьи. Е. М. Серба – разработка концепции и дизайна исследования, стратегическое управление комплексом исследований, финальное одобрение версии. Конфликт интересовАвторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. ContributionG.S. Volkova developed the concept and designed the study, analyzed and interpreted experimental data, wrote and proofread the manuscript. E.M. Serba developed the research concept and design, supervised the research complex, and approved of the final version of the manuscript. Conflict of interestThe authors declare that there is no conflict of interest regarding the publication of this article.