Санкт-Петербург, г. Санкт-Петербург и Ленинградская область, Россия
Национальный исследовательский университет ИТМО
Санкт-Петербург, Россия
Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики (младший научный сотрудник)
Санкт-Петербург, г. Санкт-Петербург и Ленинградская область, Россия
Наиболее эффективно хранение микроорганизмов различных таксономических групп при низких температурах от –12 °С до –150 °С. В статье исследовано влияние низких температур (–12 °С и –18 °С) на жизнеспособность коллекционных штаммов актиномицетов Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743 и Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734 – продуцентов ингибиторов гликозидаз в процессе хранения без криопротектора в 15 % растворе глицерина и в 0,9 % растворе натрия хлорида и биосинтетическую способность в процессе ферментации гидролизатов крахмала. Определен титр (КОЕ в 1 см3 исходного инокулята) и ингибиторная активность по отношению к панкреатической α-амилазе. Выявлено, что штаммы Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus в исходных концентрациях клеток 107 и 108 КОЕ/см3 сохранили высокий уровень жизнеспособности в течение четырех месяцев хранения в 15 % растворе глицерина и в 0,9 % растворе натрия хлорида при температурах –12 °С и –18 °С. Наибольшее количество выживших клеток получено при хранении в 15 % растворе глицерина при температуре –18 °С. Установлено, что штаммы Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus, хранившиеся в 15 % растворе глицерина при низких температурах, имеют более высокий уровень ингибиторной активности в культуральной жидкости, чем при хранении в 0,9 % растворе натрия хлорида. Показатель ингибиторной активности был выше у культур, хранившихся в 15 % растворе глицерина при температуре –18 °С, и находился на уровне 2600 ± 200 ИЕ/см3 . Показано, что низкотемпературное хранение Streptomyces не оказывает отрицательного воздействия на жизнеспособность и биосинтетическую активность культур.
Штаммы Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743 и Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734, низкотемпературное хранение, жизнеспособность, ингибиторная активность, титр
Введение Для науки и практики большой интерес представляет поддержание жизнеспособности культур, сохранение стабильности их таксономически важных признаков, а также любых других определенных свойств. В настоящее время разработаны достаточно эффективные методы долгосрочного хранения большого количества микроорганизмов, обеспечивающие у них сохранение жизнеспособности, генетическую и фенотипическую стабильность. Во всех случаях выбор способа консервирования конкретного объекта основывается на сохранении культурой жизнеспособности, морфологических признаков, физиологических характеристик, биохимической активности и генетической стабильности с учетом максимально возможного времени хранения культуры, а также надежности реализации данного метода консервации и требований по обслуживанию в течение длительного времени. В большинстве коллекций микроорганизмов используют методы лиофилизации, низкотемпературного замораживания и криоконсервации [1]. Высокий эффект консервации этими методами достигается тем, что клетки, лишаясь свободной воды в условиях субнулевых и/или криогенных температур, переходят в состояние анабиоза [2]. В последние годы для хранения микроорганизмов во все возрастающих масштабах используется низкотемпературная консервация, обеспечивающая сохранение высокого титра клеток, в связи с наличием и доступностью низкотемпературных холодильных установок, способных надежно поддерживать низкие температуры в течение длительного времени. Для защиты клеток от повреждения при замораживании бактерии суспензируют в специальных веществах – криопротекторах, чаще всего в глицерине и диметилсульфоксиде. Также могут быть использованы сахароза, лактоза, глюкоза, маннит, сорбит, поливинилпирролидон, полигликоль и т. д., которые обеспечивают защитное действие на наружной поверхности клеточной мембраны [3, 4, 5]. В литературе есть данные, что жизнеспособность микроорганизмов значительно повышается, если исходная концентрация клеток в суспензии была высокой (109 –1011 КОЕ/см3 ). Уплотненные суспензии клеток имеют более высокий титр выживания, чем разбавленные, так как лизированные клетки и клеточные вещества могут выполнять криозащитную роль [6]. Известно, что актиномицеты – продуценты антибиотиков часто сохраняют исходный уровень антибиотической активности при консервации спор на высушенных питательных средах или в почве, а также в лиофилизованном состоянии [7]. Известен способ хранения Streptomyces hygroscopicus RIA 1433, Nonomuraea Sp. – продуцентов антибиотиков при температуре –70 °С [8]. Коллекционные культуры Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743 и Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734 Всероссийского научноисследовательского института пищевых добавок являются продуцентами ингибиторов гликозидаз – биологически активных веществ и потенциальных пищевых микроингредиентов [9]. Целью работы является исследование влияния низких температур (–12 °С и –18 °С) на выживаемость культур Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743 и Streptomyces violaceus и сохранение ими ингибиторной активности в процессе хранения. Объекты и методы исследования Объектом исследования являлись два штамма актиномицетов Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus, селекционированных во ВНИИПД и депонированных во Всероссийской Коллекции Промышленных микроорганизмов под коллекционными номерами ВКПМ Ас-1743 и ВКПМ Ас-1734 [10,11]. Штаммы актиномицетов Streptomyces хранились при температурах –12 °С и –18 °С. Закладку на хранение проводили методом смыва со скошенной агаровой крахмалсодержащей среды Чапека. Использовали споровые суспензии с исходными концентрациями 107 –108 КОЕ/см3 . В качестве защитного вещества при хранении при низких температурах использовали 15 % раствор глицерина и 0,9 % раствор хлорида натрия (физраствор). Культуры Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus хранили при низких температурах в течение четырех месяцев. В заложенных на хранение культурах определяли титр (КОЕ в 1см3 исходного инокулята) [12]. Процесс восстановления замороженных клеток осуществляли путём быстрого оттаивания при Vybornova T.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2018, vol. 48, no. 3, pp. 34–40 36 температуре +37 °С в течение 3 минут и слабом встряхивании. Число жизнеспособных клеток определяли методом посева размороженных культур на чашки Петри с агаровой крахмалосодержащей средой Чапека [12]. Глубинное культивирование Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus проводили на гидролизате кукурузного крахмала периодическим способом в условиях шейкера-инкубатора Multitron (INFORS, Швейцария) в колбах вместимостью 750 см3 со скоростью перемешивания 160 ± 20 оборотов в минуту при температуре +29 ± 1 °С в течение пяти суток [10, 11]. Состав среды для ферментации (г/дм)3 : гидролизат крахмала с декстрозным эквивалентом ДЕ = 25 ± 5 % – 20; соевая мука – 5,0; натрий хлористый – 3,0; калий фосфорнокислый двузамещенный – 1,0; магний сернокислый семиводный – 0,5; рН 7,0 [13]. Для гидролиза кукурузного крахмала использовали ферментный препарат Амилосубтилин Г3х с амилолитической активностью 850 ед/г (ГОСТ 23635-90). Ингибиторную активность выросших после хранения КОЕ определяли в инактивированных нативных растворах колориметрическим методом по отношению к панкреатической α-амилазе (тестфермент) [14]. Инактивацию собственной амилазы проводили нагреванием растворов до +98 ± 1 °С. Ингибиторное действие изучали по отношению к панкреатической амилазе («Sigma», США). Обработку экспериментальных данных проводили с привлечением методов математической статистики и программ Excel XP. Результаты и их обсуждение Результаты проведенных исследований показали, что при замораживании споровых суспензий штаммов Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743 и Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734 в концентрациях 107 –108 КОЕ/см3 клетки исследуемых культур сохранили высокую жизнеспособность после 4 месяцев хранения при температурах –12 °С и –18 °С. При хранении при температуре –18 °С в 15 % растворе глицерина у обоих штаммов титр клеток сохранился практически на исходном уровне. При хранении культур при этой же температуре в 0,9 % растворе натрия хлорида число жизнеспособных клеток снижается на 7–10 %. Для Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743 титр находился в пределах от 1,48 × 108 до 1,66 × 108 КОЕ/см3 , для Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734 – от 8,49 × 107 до 8,61 × 107 КОЕ/см3 (табл. 1). Полученные показатели находятся на уровне требований по низкотемпературному хранению бактериальных культур. Без применения криопротектора штаммы сохраняют свою жизнеспособность в течение 4 месяцев хранения с численностью КОЕ 9,81 × 107 КОЕ/см3 для Streptomyces lucensis и 6,35 × 107 КОЕ/см3 для Streptomyces violaceus, что составляет 66,3 % и 76,3 % от исходного значения. Количество КОЕ после четырех месяцев хранения также удовлетворяет требованиям для биологических препаратов, содержащих бактерии [5]. Полученные данные свидетельствуют о высокой адаптационной способности сохранению штаммов к понижению температуры и жизнеспособности в стрессовых условиях. Исследуемые штаммы Streptomyces обладают способностью синтезировать ингибиторы свиной панкреатической α-амилазы. Поэтому, помимо исследований по влиянию низких температур на жизнеспособность культур, оценивали их биосинтетическую способность в процессе хранения по показателю «ингибиторная активность». На протяжении всего периода хранения проводился контроль ингибиторной активности по отношению к панкреатической α-амилазе (тестфермент). Результаты настоящего исследования показали, что степень ингибирования панкреатической α-амилазы для исследуемых штаммов независимо от условий хранения (в присутствии криопротектора или в 0,9 % растворе натрия хлорида) находилась в пределах от 10 % до 55 %, что соответствует значению показателя до закладки на хранение. Ингибиторная активность исследуемых штаммов стрептомицетов, хранившихся в 0,9 % растворе натрия хлорида, была ниже в 1,1–1,2 раза, чем при хранении в 15 % растворе глицерина. Данная Таблица 1 – Жизнеспособность исследуемых культур Streptomyces при хранении при –12 °С и –18 °С Table 1 – The viability of the cultures of Streptomyces during storage at minus 12 °C and minus 18 °C Название штамма Наличие криопротектора Число жизнеспособных клеток, КОЕ/см3 До закладки на хранение –12 °С –18 °С через 1 месяц через 4 месяца через 1 месяц через 4 месяца Streptomyces lucensis нет 1,48 ± 0,25 × 108 9,60 ± 0,87 × 107 8,48 ± 0,54 × 107 9,81 ± 0,82 × 107 8,76 ± 0,33 × 107 15 % р-р глицерина 1,64 ± 0,15 × 108 1,48 ± 0,17 × 108 1,60 ± 0,22 × 108 1,60 ± 0,12 × 108 1,66 ± 0,14 × 108 0,9 % раствор натрия хлорида 1,62 ± 0,18 × 108 1,34 ± 0,12 × 108 1,38 ± 0,11 × 108 1,46 ± 0,16 × 108 1,54 ± 0,13 × 108 Streptomyces violaceus нет 8,32 ± 0,72 × 107 5,64 ± 0,60 × 107 5,12 ± 0,44 × 107 6,00 ± 0,55 × 107 6,35 ± 0,24 × 107 15 % р-р глицерина 8,60 ± 0,56 × 107 8,51 ± 0,81 × 107 8,49 ± 0,35 × 107 8,57 ± 0,74 × 107 8,61 ± 0,38 × 107 0,9 % раствор натрия хлорида 8,55 ± 0,77 × 107 8,20 ± 0,53 × 107 8,16 ± 0,36 × 107 8,24 ± 0,65 × 107 8,40 ± 0,52 × 107 Выборнова Т. В. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2018. Т. 48. № 3 С. 34–40 37 закономерность наблюдалась в ранее проведенных нами исследованиях по изучению свойств Streptomyces в процессе хранения [2]. Глицерин уменьшает концентрацию электролитов, изменяет структуру воды вне клеток, действует на поверхность и проницаемость мембран, тем самым предотвращая нарушение биохимических процессов в клетках микроорганизмов во время замораживания [5]. При температуре хранения –18 °С в 15 % растворе глицерина ингибиторная активность штаммов Streptomyces сохранялась на более высоком уровне, чем при –12 °С и составляла для штамма Streptomyces lucensis 1780 ± 100 ИЕ/см3 , для штамма Streptomyces violaceus 2600 ± 100 ИЕ/см3 (табл. 2). При более резком перепаде температур (с –18 °С на +37 °С) интенсифицируется восстановление биохимических реакций в ответ на стрессовое воздействие. Так, Streptomyces 4Alga, выделенный из растительности, произрастающей в Антарктиде, обладает высокой стрессоустойчивостью к пониженным температурам [17]. Культура не только сохраняет жизнеспособность, но и синтезирует амилолитические ферменты с повышенной активностью при температуре культивирования от +5 °С до +20 °С. При температурах +28 °С и +37 °С, близких к оптимуму культивирования стрептомицетов на крахмалсодержащих средах (29 °С), амилолитическая активность была в 1,2–1,5 раза ниже. После первого пассажа максимальной ингибиторной способностью обладал штамм Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734. На рисунке 1 представлены значения ингибиторной активности штамма Streptomyces violaceus, хранившегося при температурах –12 °С и –18 °С и имеющего наиболее высокий уровень активности ингибитора панкреатической α-амилазы в культуральной жидкости. Синтез ингибитора начинается на 2 сутки культивирования, достигает максимума на 3–4 сутки, а на 5 сутки происходит значительное уменьшение уровня активности ингибитора. На 1 сутки культивирования активизируется собственная ферментная система актиномицета, происходит накопление биомассы, сопровождаемое интенсивным потреблением компонентов питательной среды (источников углерода, азота, солей) [13]. Значительное снижение ингибиторной активности на 120 ч культивирования штаммов стрептомицетов обусловлено завершением продуктивного синтеза ингибитора и «старением» культуры. Другим возможным объяснением может быть образование менее активных форм ингибитора. Как было показано в ранее проведенных исследованиях, синтезируемые ингибиторы панкреатической α-амилазы имеют углеводную природу [13]. Поэтому возможен гидролиз углеводных цепей ингибиторов под действием собственных амилаз продуцентов. Подтверждением вышесказанному является подверженность ингибиторов, синтезируемых культурами Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus, действию глюкоамилазы Aspergillus niger. Значения константы Михаэлиса, показывающая сродство в данном случае фермента к синтезируемому ингибитору, как к субстрату, составили соответственно 1,2 ± 0,1 × 10-2 М и 1,8 ± 0,1 × 10-2 М [15]. Таблица 2 – Ингибиторная активность в нативных растворах при низкотемпературном хранении (в конце процесса ферментации) Table 2 – The inhibitory activity in native solutions during the low-temperature storage (at the end of the fermentation process) Наименование штамма Ингибиторная активность, ИЕ/см3 до закладки на хранение –12 °С –18 °С 1 месяц 4 месяца 1 месяц 4 месяца Streptomyces lucensis 1640 ±100 Хранение в 15 % растворе глицерина 1600 ± 100 1635 ± 100 1700 ± 100 1780 ± 100 Хранение в 0,9 % растворе натрия хлорида 1335 ± 100 1386 ± 100 1600 ± 100 1505 ± 100 Streptomyces violaceus 2465 ± 100 Хранение в 15 % растворе глицерина 2400 ± 100 2390 ± 100 2650 ± 200 2600 ± 200 Хранение в 0,9 % растворе натрия хлорида 2120 ± 100 1975 ± 100 2330 ± 200 2360 ± 100 0 700 1400 2100 2800 24 48 72 96 120 Ингибиторная активность, ИЕ/см3 Длительность культивирования, ч Рисунок 1 – Значения ингибиторной активности Streptomyces violaceus ВКПМ Ac-1734, хранившегося при температурах –12 °С и –18 °С в 15 % растворе глицерина, в процессе культивирования Figure 1 – The values of inhibitory activity of Streptomyces violaceus VKPM Ac-1734 stored at temperatures of minus 12°C and minus 18°C in a 15% glycerol solution, during cultivation 0 700 1400 2100 2800 24 48 72 96 120 Ингибиторная активность, ИЕ/см3 Длительность культивирования, ч хранение при –12 °C; 0 700 1400 2100 2800 24 48 72 96 120 Ингибиторная активность, ИЕ/см3 Длительность культивирования, ч хранение при –18 °C Vybornova T.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2018, vol. 48, no. 3, pp. 34–40 38 Как известно, спороформирующие культуры сохраняют высокую жизнеспособность почти при всех методах консервации [16]. Это обусловлено минимальным содержанием в спорах воды. Исследуемые штаммы стрептомицетов являются спорообразующими, что позволяет изначально рассматривать их состояние как естественную форму консервации. Методы непродолжительного хранения культур Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus, к которым относится хранение клеток в водносолевом растворе (0,9 % раствор натрия хлорида) при температуре от –10 до –20 °С, позволяют заметно продлить жизнеспособность штаммов и сохранить их биосинтетическую активность. Необходимо определить эти показатели после более длительного периода хранения, так как возможны повреждения клеток в растворах электролитов и генетический обмен между ними, следствием которого является неконтролируемая селекция культуры. Полученные данные свидетельствуют о том, что низкотемпературное хранение Streptomyces не оказывает отрицательного воздействия на жизнеспособность культур и биосинтетическую способность, и позволяют сделать предположение о целесообразности проведения исследований по влиянию более низких температур (–80 °C и –150 °C) на штаммы актиномицетов Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus в процессе хранения. Выводы Проведенные исследования показали, что исследуемые штаммы актиномицетов Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus в концентрациях 107 –108 КОЕ/см3 сохраняют высокую жизнеспособность и ингибиторную активность при хранении при температурах –12 °C и –18 °C. В качестве защитной среды от повреждения клеток при замораживании для длительного хранения (без пересевов) предпочтительно использование 15 % раствора глицерина. Хранение актиномицетов при температуре –18°C обеспечивает сохранение ингибиторной активности на более высоком уровне, чем при –12 °C. Данные исследования позволяют разработать условия низкотемпературного хранения культур Streptomyces для сохранения коллекционного генофонда микроорганизмов. Конфликт интересов Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов Финансирование Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследовании государственных академий наук на 2018 г. по проекту 163.4.1.
1. Сидякина, Т. М. Консервация микроорганизмов в коллекциях культур / Т. М. Сидякина // Сборник научных трудов«Консервация генетических ресурсов. Методы. Проблемы. Перспективы» / Пущинский научный центр. - Пущино, 1991. -С. 81-159.
2. Cвойства конидий штаммов актиномицетов Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus в процессе хранения принизких температурах / Н. Ю. Шарова, Т. В. Выборнова, А. А. Принцева [и др.] // Пищевые системы. - 2018. - Т. 1, № 3. -С. 27-32. DOI: https://doi.org/10.21323/2618-9771-2018-1-3-27-32.
3. Филиппова‚ С. Н. Многолетнее хранение коллекционных культур актинобактерий / С. Н. Филиппова,Н. А. Сургучева, В. Ф. Гальченко // Микробиология. - 2012. - Т. 81, № 5. - С. 682-690.
4. Опыт долгосрочного хранения промышленных штаммов микроорганизмов / А. А. Цуцаева‚ А. Е. Ананьина,Л. М. Балыбердина [и др.] // Микробиология. - 2008. - Т. 77, № 5. - С. 696-700.
5. Чукпарова, А. У. Оценка сохранения жизнеспособности штаммов микроорганизмов при низкотемпературнойконсервации / А. У. Чукпарова // Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Биологическиактивные вещества микроорганизмов - прошлое, настоящее, будущее» / Московский государственный университет имениМ. В. Ломоносова. - М., 2011. - 131 с.
6. Пат. № 2123044 Российская Федерация, МПК C12N1/04, C12N1/00. Способ длительного хранения естественныхсимбиотических ассоциаций микроорганизмов человека и животных / Шендеров Б. А., Гахова Э. Н., Манвелова М. А. [и др.];заявитель и патентообладатель ОАО «Русский йогурт». - № 98103006/13; заявл.1998-0302; опуб. 10.12.1998.
7. Промышленная микробиология / З. А. Аркадьева, А. М. Безбородов, И. Н. Блохина [и др.]. - М.: Высшая школа,1989. - 688 с.
8. Хранение культур актинобактерий - представителей родов Streptomyces и Nonomuraea методом низкотемпературной консервации / О. Н. Синева, Н. Г. Куликова, С. Н. Филиппова [и др.] / /Антибиотики и химиотерапия. - 2014. - Т. 59, № 11-12. - С. 11-15.
9. Sharova, N. Yu. Amylase inhibitors from Streptomyces lucensis VKPM Ac-1743 and Streptomyces violaceus VKPM Ac1734 / N. Yu. Sharova // Applied Biochemistry and Microbiology. - 2015. - Vol. 51, № 1. - P. 58-63. DOI: https://doi.org/10.1134/ S0003683815010159
10. Патент № 2346042 Российская Федерация, МПК С12N 1/2.0. Штамм актиномицета Streptomyces violaceus - продуцент ингибитора гликозидаз / Шарова Н. Ю., Никифорова Т. А., Позднякова Т. А.; заявитель и патентообладатель ГУ ВНИИПАКК. - № 2006138251/13; заявл. 30.10.2006; опубл. 10.02.2009; Бюл. № 4.
11. Патент № 2355755 Российская Федерация‚ МПК С 12N 9/24. Штамм актиномицета Streptomyces lucensis - продуцент ингибитора гликозидаз / Шарова Н. Ю., Позднякова Т. А., Ходкевич О. А.; заявитель и патентообладатель ГУ ВНИИПАКК. - № 2008101164/13; заявл. 09.01.2008; опубл. 20.05.2009; Бюл. № 14.
12. ГОСТ 10444.15-94. Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов. М. : Стандартинформ, 2010.
13. Ходкевич, О. А. Разработка технологии биосинтеза ингибитора α-гликозидаз актиномицетами рода Streptomyces и применение комплексной добавки на его основе в хлебопечении: дис. … канд. техн. наук: 05.18.07 / Ходкевич Ольга Анатольевна. - СПб, 2009. - 135 с.
14. Акулова, Н. Ю. Ингибиторы α-глюкозидаз из Streptomyces. Выделение и свойства: автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.00.04 / Акулова Наталья Юрьевна. - СПб, 1993. - 22 с.
15. Шарова, Н. Ю. Разработка научных основ новых технологий пищевых добавок и ингредиентов с использованием крахмалсодержащего сырья: автореф. дис. … докт. биол. наук: 05.18.07 / Шарова Наталья Юрьевна. - СПб, 2013. - 32 с.
16. Похиленко, В. Д. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития/ В. Д. Похиленко, А. М. Баранов, К. В. Детушев // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинскиенауки. - 2009. - Т. 12, № 4. - С. 99-121.
17. Screening of polar streptomycetes able to produce cold-active hydrolytic enzymes using common and chromogenic substrates / M. Cotarlet, G. Bahrim, T. Negoita [et al.] // Romanian Biotechnological Letters. - 2008. - Vol. 13, № 5. - P. 69-80.
