Publication text
(PDF):
Read
Download
В последние годы отечественными специалистами интенсивно проводятся исследования в области технологий импортозамещения. Так, в ФГБНУ ВНИИ пивоваренной, безалкогольной и винодельческой промышленности под руководством академика Л.А. Оганесянца разработаны технологии крепких спиртных напитков на основе зерновых дистиллятов [1, 2], переработки плодово-ягодного сырья, такого как груши [3], шелковица [4, 5] и вишни [6]. Анализ динамики производства и потребления алкогольной продукции из растительного сырья свидетельствует о достаточно ограниченном ассортименте и незначительных объемах выпуска отечественных спиртных напитков на его основе. В частности, в Российской Федерации практически не производятся спиртные напитки из плодового сырья, несмотря на то что отечественная сырьевая база довольно обширна. В то же время во многих европейских странах выпускаются высококачественные спиртные напитки из плодов и ягод. Наибольшее распространение получили плодовые водки из груши, вишни, сливы и др. плодов, при производстве которых большое внимание уделяется максимальному сохранению плодового аромата и вкуса исходного сырья. Такое положение объясняется тем, что в нашей стране отсутствуют технологии, обеспечивающие получение высококачественной продукции, которая могла бы составить конкуренцию импортной продукции и способствовать ее замене спиртными напитками отечественных производителей. В связи с этим в нынешних условиях вопросом первостепенной важности является разработка отечественных инновационных технологий производства высококачественных спиртных напитков из плодового сырья. Одной из наиболее распространенных плодовых культур в России наряду с яблоней является вишня, которая занимает второе место по площади насаждений. Анализ литературных данных по химическому составу плодов вишни разных сортов свидетельствует о широких возможностях ее применения в качестве сырья для производства вишневых дистиллятов и плодовых водок. По разным данным плоды вишни накапливают от 12,5 до 24,3 % растворимых сухих веществ, при этом массовая доля сахаров составляет от 8,0 до 15,0 % при довольно высокой кислотности - от 0,4 до 3,0 % [7, 8]. Одним из наиболее распространенных сортов вишни в европейской части Российской Федерации является сорт Владимирская. К достоинствам сорта Владимирская следует отнести ее универсальность - высококачественные плоды пригодны как для потребления в свежем виде, так и для переработки и до недавнего времени широко использовались в качестве сырья в плодовом виноделии. Исследованиями отечественных и зарубежных ученых установлено, что на состав летучих компонентов, определяющих качественные характеристики фруктовых дистиллятов, значительное влияние оказывают технологические приемы, используемые при первичной переработке сырья, его мацерации и сбраживания [9-11]. Определяющее значение при этом имеют процессы брожения, основанные на жизнедеятельности культурных дрожжей рода Saccharomyces, в процессе метаболизма которых, помимо этилового спирта, образуется основная часть летучих компонентов, представляющих собой вторичные и побочные продукты спиртового брожения [12, 13]. Большое разнообразие используемых в виноделии рас дрожжей, в том числе высокоэффективных препаратов активных сухих дрожжей (АСД), обладающих различной ферментативной активностью и способностью к образованию вторичных продуктов брожения, дает широкую возможность выбора подходящих рас для сбраживания различных видов плодового сырья. В этой связи целью наших исследований явилось изучение влияния различных рас дрожжей рода Saccharomyces на процесс сбраживания вишневой мезги и образование летучих компонентов. Объекты и методы исследований В качестве объектов исследований использованы свежие плоды вишни (Prúnus subg. Cerásus) сорта Владимирская и сброженная вишневая мезга, полученная путем сбраживания в анаэробных условиях при температуре (20±2) °С до содержания остаточных сахаров не более 3,0 г/дм3 с использованием различных рас дрожжей. Для определения микробиальной чистоты посев образцов свежей вишневой мезги производили на питательные селективные среды (фирма Sartorius, Германия). Определение трех групп микроорганизмов (дрожжей, уксуснокислых и молочнокислых бактерий) проводилось методом мембраной фильтрации. Высеваемый объем исследуемого образца для определения каждой группы микроорганизмов - 100 см3. Для определения дрожжей и уксуснокислых бактерий использовали питательную среду Word. При определении уксуснокислых бактерий на поверхность питательной среды вносили 1-2 капли этилового спирта 3,0-5,0 % об. Молочнокислые бактерии культивировали на среде Orange Serum в анаэробных условиях в анаэростате в течение трех суток. Подбор рас винных дрожжей для проведения эксперимента осуществлялся с учетом особенностей используемого сырья и по характеристикам дрожжей, представленным в технической информации фирмы-производителя из имеющейся в НИИПБиВП коллекции. Были изучены характеристики 9 чистых культур дрожжей и 32 рас АСД, используемых в виноделии. По своим характеристикам АСД были условно разделены на три группы: I - расы для получения белых столовых и шампанских виноматериалов; II - расы для получения красных столовых вин; III - расы для сбраживания плодовых (фруктовых) соков. Для проведения исследований были отобраны расы из II и III группы. В работе использовали чистые культуры дрожжей (ЧКД) рода Saccharomyces vini, расы «К-17», «Вишневая 33» и АСД рода Saccharomyces cerevisiae, расы «SIHA Aktivhefe 3», «CD». Раса «К-17» - дрожжи, традиционно используемые для сбраживания плодового сусла. Раса «К-17» получена путем отбора наиболее активных пектинрасщепляющих форм с последующим усилением полезных свойств путем направленного культивирования на соответствующих средах. Универсальная раса с повышенной пектинрасщепляющей способностью. Дрожжевые клетки имеют округлую или овальную, несколько вытянутую форму, шириной 3,3-7,3 мкм, длиной 3,3-11,4 мкм. Размножаются почкованием. Раса «Вишневая 33» - дрожжи рода Saccharomyces vini. Раса выделена в 1937-1938 гг. Д.К. Чаленко (ЦНИЛВП) в г. Курске из осадка быстро сбродившего вишневого сока. Раса считается универсальной и применяется для сбраживания высококислотных фруктовых соков. Забраживание происходит на 2-3-и сутки. Дрожжевые клетки на 4-5-е сутки имеют овальную или яйцевидную форму шириной 2,3-6,8 мкм и длиной 3,3-8,8 мкм. Раса «CD» - дрожжи рода Saccharomyces cerevisiae bayanus (Франция). Сухие дрожжи «CD» используются для брожения базовых вин и возобновления замедленного брожения. Можно применять для белых и красных вин, а также вин, сырьем которых служит сок фруктов, яблок или груш. Широкий температурный диапазон брожения - от 15 до 30 °С. Преимущества: короткая лаг-фаза, быстрое забраживание, незначительное образование летучих кислот; небольшая потребность в усвояемом азоте. Среднее пенообразование. Раса «SIHA Aktivhefe 3» - дрожжи рода Saccharomyces cerevisiae, раса «SIHA Aktivhefe 3», концентрат из естественных винных дрожжей (Германия), адаптированный к брожению при низких температурах с высокой ферментативной активностью. Достоинства - быстрое начало брожения и надежное полное выбраживание даже при неблагоприятных условиях. Раса используется для сбраживания сусел, мезги, разбавленных концентратов фруктовых соков, а также для дображивания вин после перерывов в брожении. Оптимальная температура брожения - 15-22 °С. Дрожжи могут выработать до 16 % алкоголя. Для установления преимущества той или иной расы дрожжей при сбраживании плодового сырья используются различные способы и приемы определения физиологического состояния дрожжей, их бродильной активности и способности продуцировать вторичные продукты брожения. При этом важное значение имеет не только химический состав сырья, но и его физические характеристики. Плодовая мезга в отличие от сусла содержит большое количество твердых частиц кожицы и мякоти, что создает особые условия для дрожжей. Расы «К-17» и «Вишневая 33» были взяты в виде чистой культуры дрожжей на солодовом скошенном сусле - агаре. Для приготовления разводки дрожжевую культуру петлей перенесли в колбу со стерилизованной питательной средой. Для приготовления питательной среды вишневый сок разбавляли умягченной водой в соотношении 1:1, в смесь добавляли инвертированный сахарный сироп до содержания сахара в смеси 200 г/дм3. Приготовленную смесь стерилизовали путем кратковременного нагрева до температуры кипения с последующим охлаждением до 28 °С. Колбу закрыли ватной пробкой и выдерживали в термостате в течение 24 часов при t = 28 °С для разбраживания. Количество дрожжевых клеток и их состояние контролировали методом прямого микроскопирования с подсчетом клеток в счетной камере Горяева. Дрожжевая разводка считалась готовой к внесению в мезгу при достижении количества дрожжевых клеток 135-140 млн/см3. Разводка вносилась в подготовленную мезгу в количестве 3 % от объема мезги. Расы «SIHA Aktivhefe 3» и «CD» были взяты в виде АСД. Приготовление разводки производилось по следующей схеме: взвешивание навески дрожжей (из расчета 1,5 г на 1 дм3 мезги), разбавление умягченной водой температурой 35 ºС в 10-кратном количестве, выдержка 20 минут с периодическим перемешиванием, внесение стерильного вишневого сока в 2-кратном объеме, выдержка 20 минут с периодическим перемешиванием, микроскопирование, внесение в мезгу в количестве, обеспечивающем в начальный период содержание дрожжевых клеток не менее 3 млн/см3. Микроскопические исследования проводили при помощи микроскопа МБИ-6 при увеличении ×400. Бродильную активность дрожжей по отношению к вишневой мезге определяли по количеству выделившегося диоксида углерода (весовой метод) и скорости сбраживания сахаров. Физико-химические показатели сырья и сброженной мезги определяли методами анализов, установленными в национальных стандартах РФ. Качественный и количественный состав сахаров, органических кислот и глицерина в свежем и сброженном сырье определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Метод качественного и количественного определения моно-, дисахаров и глицерина с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии осуществляли на жидкостном хроматографе с рефрактометрическим детектором и колоночным термостатом, снабженном автоматической системой сбора и обработки информации Аgilent Technologies 1200 Series (Agilent, США). Для определений использовали колонку хроматографическую Luna 5u NH2 100А 250x4,6 мм (Phenomenex, США) с предколонкой. Применяли следующие рабочие параметры жидкостного хроматографа: скорость потока элюента (смесь деионизированной дистиллированной воды с ацетонитрилом в соотношении 3:1) - 1,2 см3/мин, температура термостата детектора - 30 °С, температура термостата колонки - 30 °С, объем инжекции пробы - 20 мкл. Качественный и количественный состав органических кислот определяли на том же приборе с использованием колонки Thermo ODS Hipersil 250x4,6 мм (Thermo, CША), УФ-детектора при следующих рабочих параметрах: элюент - 0,025 М раствор калия фосфорнокислого однозамещенного, скорость потока элюента - 0,8 см3/мин, температура термостата колонки не выше 25 °С, объем инжекции - 20 мкл, длина волны поглощения УФ - 210 нм. Качественный и количественный состав летучих компонентов определяли газохроматографическим методом на хроматографе «Кристалл 5000.1» («Хроматек», Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Хроматографическая колонка НР FFАР: длина - 50 м, внутренний диаметр - 0,32 мм. Режимные параметры работы хроматографа: начальная температура термостата колонок - 70 °С, продолжительность выдержки - 6 мин., скорость нагрева термостата колонок до температуры 180 °С - 12 °С/мин., продолжительность выдержки - 15 мин., температура испарителя (инжектора) - 200 °С, температура детектора - 200 °С, коэффициент деления потока - 30:1, скорость потока газа-носителя (азот) - 1,3 см3/мин., скорость потока воздуха - 200 см3/мин., скорость потока водорода - 20 см3/мин., объем пробы - 1 мм³. Результаты и их обсуждение Важным показателем оценки активности используемой расы дрожжей является интенсивность сбраживания сахаров и чистота брожения. Перед внесением дрожжевой разводки в вишневую мезгу определяли ее микробиальную чистоту описанными методами. Свежая вишневая мезга не содержала уксуснокислых и молочнокислых бактерий, кислотопонижающие дрожжи отсутствовали. Микробиологический контроль чистоты брожения не выявил посторонних микроорганизмов в бродящей мезге. Отмечено более интенсивное размножение дрожжей в образцах мезги, сбраживаемых расами «SIHA Aktivhefe 3» и «CD» - количество почкующихся клеток в начальный период брожения в этих образцах было больше на 16 и 18,5 % соответственно, чем в образцах, сбраживаемых расами «К-17» и «Вишневая 33». Из данных, представленных на рис. 1, видно, что в образце, полученном с использованием дрожжей расы «SIHA Aktivhefe 3», процесс брожения проходил более интенсивно, чем в остальных образцах, и на восьмой день был полностью завершен. При этом массовая концентрация сахаров в данном образце составляла 2,0 г/дм3, тогда как в остальных образцах этот показатель был выше. Наименьшую активность проявила раса дрожжей «К-17». Вследствие более длительного забраживания вишневой мезги на данной расе концентрация сахаров на восьмые сутки составляла 10,0 г/дм3. Окончательно процесс брожения в этом образце завершился только на 11-е сутки. Скорость брожения в данном случае является очень важным экономическим и технологическим фактором. При медленном брожении не только снижается коэффициент оборачиваемости технологических емкостей, но и существует опасность развития посторонней микрофлоры, так как применение сернистого ангидрида при сбраживании сырья, предназначенного для последующей дистилляции, не допускается [11]. Рис. 1. Динамика изменения массовой концентрации сахаров в процессе брожения вишневой мезги В полученных образцах сброженной вишневой мезги определяли основные физико-химические показатели (табл. 1). Как видно из полученных данных, раса дрожжей практически не влияет на величину водородного показателя, pH во всех образцах сброженной мезги практически одинаков и не превышает значение 3,4, а концентрация титруемых кислот варьируется в достаточно широких пределах - от 8,3 до 13,3 г/дм3. Значительное снижение титруемой кислотности в образце, сброженном расой «CD», вероятно, обусловлено использованием ди- и трикарбоновых органических кислот сырья дрожжевыми клетками в процессе их метаболизма. Также стоит отметить довольно существенную разницу по содержанию глицерина. Известно [12], что глицерин как трехатомный спирт способен образовывать простые и сложные эфиры, которые могут оказывать отрицательное влияние на аромат сброженной мезги и полученные из нее дистилляты. Максимальное количество глицерина было образовано дрожжами расы «CD» (5,05 г/дм3), а минимальное (3,7 г/дм3) - расой «SIHA Aktivhefe 3». Таблица 1 Влияние расы дрожжей на физико-химические показатели сброженной вишневой мезги Показатели Свежая вишневая мезга Сброженная вишневая мезга с использованием различных рас дрожжей «Вишневая-33» «К-17» «CD» «SIHA Aktivhefe 3» pH 3,2 3,4 3,3 3,3 3,3 Объёмная доля этилового спирта, % - 6,7 5,6 5,8 6,7 Массовая концентрация, г/дм3: сахаров 117,0 2,8 4,0 3,6 2,0 глицерина - 4,2 4,6 5,0 3,7 титруемых кислот 13,8 12,0 11,4 8,3 13,3 летучих кислот - 0,2 0,2 0,2 0,1 Таблица 2 Влияние расы дрожжей на состав органических кислот в сброженной вишневой мезге Наименование кислоты Массовая концентрация, г/дм3 Свежая мезга Образец № 1 («Вишневая 33») Образец № 2 («К-17») Образец № 3 («CD») Образец № 4 («SIHA Aktivhefe 3») Щавелевая 0,05 0,01 0,02 0,03 - Винная 0,09 0,15 0,11 0,10 0,17 Яблочная 13,30 11,20 10,28 7,62 12,62 Молочная - 0,38 0,65 0,20 0,17 Муравьиная - 0,05 0,03 0,03 0,03 Лимонная 0,13 0,16 0,20 0,21 0,14 Янтарная 0,07 - - - - Известно, что расы дрожжей различаются не только по способности синтезировать вторичные продукты брожения, но и по интенсивности потребления компонентов сырья, в том числе органических кислот. Кроме того, органические кислоты, взаимодействуя со спиртами, образуют ряд сложных эфиров, участвующих в сложении аромата плодового дистиллята [11, 13]. В связи с этим было важно изучить изменение органических кислот вишневой мезги в процессе брожения. Как видно из данных, представленных в табл. 2, состав органических кислот в свежей вишне преимущественно представлен яблочной кислотой, имеющей наиболее существенную концентрацию - 13,3 г/дм3, по сравнению с другими кислотами (щавелевой, винной, лимонной, янтарной), содержание которых составляет от 0,05 до 0,13 г/дм3. Выявлено, что в результате брожения состав органических кислот вишни претерпевает некоторые изменения, что обусловлено протекающими биохимическими процессами. Установлено, что концентрация яблочной кислоты во всех образцах снижается, а количество винной кислоты возрастает, при этом наибольшее ее количество образовано расой «SIHA Aktivhefe 3». Также следует отметить новообразование молочной и муравьиной кислот. Считается, что образование молочной кислоты связано со снижением концентрации яблочной кислоты, которая в свою очередь является ее предшественником в цикле трикарбоновых кислот (цикл Кребса). Как видно из полученных нами данных, снижение концентрации яблочной кислоты не всегда сопровождается повышением концентрации молочной кислоты, что в свою очередь подтверждает сведения об использовании органических кислот в качестве источников питания дрожжевой клетки. Как видно из полученных данных, изменение концентрации лимонной кислоты напрямую связано с увеличением концентрации глицерина. Наибольшая концентрация лимонной кислоты 0,20-0,21 г/дм3 обнаружена в образцах № 2 и 3. Таблица 3 Влияние расы дрожжей на качественный и количественный состав летучих компонентов в сброженной вишневой мезге Наименование компонента Массовая концентрация, мг/дм3 Образец № 1 («Вишневая 33») Образец № 2 («К-17») Образец № 3 («CD») Образец № 4 («SIHA Aktivhefe 3») Метанол 264,7 278,1 271,3 190,1 Ацетальдегид 12,4 14,5 14,7 6,4 Ацетон 0,3 0,5 0,3 0,1 Диацетил 1,5 0,5 0,6 - 1-пропанол 54,1 63,3 71,2 72,6 Изобутанол 64,2 73,9 66,5 48,3 1-бутанол 0,3 0,7 0,2 - Изоамилол 72,0 71,3 83,4 62,6 Гексанол 0,3 0,2 0,1 0,2 ФЭС 4,6 7,6 5,9 10,2 Этилацетат 9,9 13,8 8,1 6,3 Изоамилацетат - 0,3 0,2 - Этиллактат 0,6 - 1,1 2,4 Этилформиат следы следы 0,5 0,9 Этилкапроат следы следы следы 0,3 Этилкаприлат следы следы следы 0,3 Этилкапрат следы следы 0,9 2,4 Альдегиды и кетоны 14,2 15,5 15,6 6,5 Высшие спирты 195,5 217,0 227,3 193,9 Сложные эфиры 10,5 14,1 10,8 12,6 Летучие компоненты, за исключением метанола 220,2 246,6 253,7 213,0 Σ спиртов С3 / Σ спиртов С4, С5 0,40 0,44 0,48 0,66 Дегустационная оценка 6,5 6,9 7,2 7,6 Анализ данных по составу летучих компонентов, представленных в табл. 3, показывает, что высшие спирты составляют до 90 % от суммарного их содержания, однако их качественный состав различается в зависимости от использованной для брожения расы дрожжей. Наибольшее суммарное количество высших спиртов обнаружено в образце № 3 (раса «CD»), а наименьшее в образце № 4 (раса «SIHA Aktivhefe 3»). Концентрация вторичных спиртов с группой (ОН-) у второго атома углерода (пропанол-2 и бутанол-2) во всех образцах обнаружена в следах, также обнаружены высшие спирты - гексанол, бутанол-1, пропанол-1. В наибольшей концентрации 1-пропанол обнаружен в образцах № 3 и 4. Концентрация гексанола, обладающего цветочно-травянистым оттенком, в опытных образцах находилась в пределах 0,1-0,3 мг/дм3. Вместе с тем, применение расы «SIHA Aktivhefe 3» позволяет получить сброженную вишневую мезгу с максимальным значением отношения концентрации спиртов С3 (пропиловые спирты) к сумме спиртов С4, С5 (бутиловые и амиловые спирты). Одним из важных показателей плодовых дистиллятов с точки зрения безопасности является концентрация метанола. Присутствие метанола в концентрации до 278,1 мг/дм3 обусловлено ферментативным разрушением пектиновых веществ вишни под действием ферментов дрожжевой клетки. Как видно из представленных данных, в наименьшем количестве метанол образуется дрожжами «SIHA Aktivhefe 3», что, вероятно, обусловлено особенностями их метаболизма. Содержание ацетальдегида, обладающего фруктовым ароматом в небольших концентрациях и резким неприятным запахом - в концентрациях свыше 300 мг/дм3, во всех образцах сброженной мезги невысокое. Значения ацетона и диацетила, отвечающих за посторонние тона в аромате сброженного сырья, также варьируют в зависимости от применяемой расы дрожжей. Наименьшее количество ацетона - 0,1 мг/дм3 обнаружено в образце № 4 (раса «SIHA Aktivhefe 3»), а диацетил в данном образце не обнаружен. Пороговая концентрация восприятия диацетила составляет от 0,7 до 0,8 мг/дм3. В образце № 1 диацетил содержится в концентрации значительно выше пороговой, что может быть одной из причин появления тонов окисленности в аромате этого образца. Положительное влияние на аромат оказывает фенилэтиловый спирт, обладающий цветочно-медовым запахом, напоминающим запах розы. Его концентрация в сброженной вишневой мезге варьирует в пределах 4,6-10,2 мг/дм3, наибольшее его количество - 10,2 мг/дм3 образовано расой «SIHA Aktivhefe 3». Сложные эфиры преимущественно представлены этилацетатом. Известно, что разнообразные сложные эфиры не равноценны по своим качественным характеристикам, при этом в сложении аромата играет роль не столько суммарное количество эфиров, сколько их качественный состав. Так, присутствие этилацетата, придающего продукту в больших концентрациях тон прокисшего вина, в небольших концентрациях оказывает положительное влияние на сложение аромата. Известно, что в сильно разбавленном виде этилацетат обладает приятным эфирно-плодовым ароматом. Наибольшее количество этилацетата - 13,8 мг/дм3 обнаружено в образце № 2 (раса «К-17»), а наименьшее - 6,3 мг/дм3 образовано расой «SIHA Aktivhefe 3». Следует отметить, что кроме этилацетата в образце № 4 (раса «SIHA Aktivhefe 3») в небольших количествах обнаружены этиллактат, компоненты энантового эфира (этилкапрат, этилкапроат и этилкаприлат), в остальных образцах они обнаружены в меньших количествах или в следах. По результатам органолептической оценки наилучшую характеристику получил образец № 4 (брожение на расе «SIHA Aktivhefe 3»). Он обладал чистым плодовым ароматом, характерным для свежей вишни, и приятным гармоничным вкусом. Образец № 3 уступал ему по интенсивности и типичности аромата и вкуса за счет присутствия тонов сухофруктов. Мезга, сброженная расами «Вишневая 33» и «К-17», значительно уступала по интенсивности и чистоте аромата и вкуса. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что раса дрожжей «SIHA Aktivhefe 3» в наибольшей степени подходит для сбраживания вишневой мезги. Она обеспечивает наиболее полное выбраживание сахаров и, соответственно, более высокое накопление этилового спирта, а также способствует накоплению оптимального состава ценных ароматических компонентов.